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文獻分享:【Microbiome goes to the ICU】 肺部微生物群預示危重病人臨床預后

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  • 發布時間:2020-05-06 18:54
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文獻分享:【Microbiome goes to the ICU】 肺部微生物群預示危重病人臨床預后

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  導讀

 

  16S擴增子測序、metagenomics測序等不依賴于培養的技術手段的發展極大推動了微生物組學研究,之前被認為無菌的肺部實際上存在著復雜、動態變化的細菌群落。進一步探究發現,危重病人肺部微生物群相比正常個體發生了意義深遠的改變,此種變化可能加重肺泡炎癥并延長炎癥持續的時間,但對于肺部微生物群與危重病人臨床預后的關系一直未有結論。密西根大學醫學院肺科和重癥學科Robert P. Dickson教授及其團隊,近期于American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine雜志上發表了危重病人肺部微生物群與臨床預后的相關性研究,證實對于機械通氣危重癥患者,入院時肺部微生物群的兩大特征——細菌載量(bacterial DNA burden)和菌群組成(community composition)——可指示病程發展,具體來說肺部細菌DNA含量增加及腸道相關細菌類群(Lachnospiraceae 和Enterobacteriaceae科)的富集預示不良臨床預后和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的發生,支持了先前“腸道菌向肺部轉移是肺損傷病因之一”的假說。此項研究強調了針對危重病人檢測肺部微生物群的重要臨床意義,肺部微生物群作為一個重要但未被充分認識的臨床異質性的來源,解釋了臨床表征相似的病人病情發展的差異,提示針對肺部微生物群的干預、調控或可成為危重病人潛在治療方案。

 

  英文題目:Lung Microbiota Predict Clinical Outcomes in Critically Ill Patients [1]

 

  中文題目:肺部微生物群可預測危重病人的臨床預后

 

  發表期刊:American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine (IF 16.494)

 

  發表時間:2020年1月

 

  作者及單位:Dickson R P, Schultz M J, van der Poll T等,密西根大學醫學院肺科和重癥醫學部

 

  材料與方法

 

  此項前瞻性觀察隊列研究以進入ICU的機械通氣危重病人為研究對象,患者進入ICU后24小時內,通過微支氣管肺泡灌洗法收集支氣管肺泡灌洗液樣本,對共計91例危重病人樣本利用細菌16s rRNA基因測序和微滴數字PCR兩種技術對肺部微生物群進行定性和定量分析,用以確定危重病人肺部微生物群變化與臨床預后的關系。預測指標包括細菌載量、菌群多樣性和菌群組成三大特征,將上述三項預測性指標與進入ICU后28天內無呼吸機天數進行關聯分析,同時還分析了ARDS患者相比非ARDS患者,肺部菌群組成的特點。

 

  主要結果

 

  1.1 危重病人肺部標本的微生物群區別于對照組的測序背景

 

  DNA提取及測序文庫構建等實驗試劑中可能存在細菌DNA,使得聚焦低生物量的微生物組學研究需要盡量排除污染對于研究結果的干擾。此項研究選擇低微生物量的部位(下呼吸道)進行取樣,小體積標本(mini-BAL),核酸提取前利用離心去除真核細胞,在樣本收集環節確保提取的核酸主要來源于肺部細菌DNA。

 

  為了驗證mini-BAL樣本能否檢測到不同于對照的細菌信號,研究人員設置了包括無模板對照(N=25)、AE緩沖標本(N=8)、用于DNA提取的無菌水(N=4)、提取對照樣本(N=9)和空白測序孔(N=6)在內共5組陰性對照。利用液滴數字PCR技術對細菌16S基因進行超敏定量發現mini-BAL樣本中細菌DNA明顯多于無模板對照標本。而利用16s擴增子測序技術分析細菌群落,進一步證實mini-BAL標本中檢測到的細菌明顯異于陰性對照:主成分分析表明,區別于陰性對照,mini-BAL很好的聚類,僅有部分mini-BAL與陰性對照有重疊;豐度分析顯示,陰性對照和mini-BAL兩者間細菌類群的相對豐度存在明顯差異,以陰性對照中占比25.5%的優勢菌群OUT008: Pelomonas為例,其在mini-BAL中占比僅為2.6%。

 

  以上結果表明,盡管mini-BAL樣本間細菌DNA含量差異較大,且存在外源污染的可能性,但是仍然能夠檢測到不同于陰性對照、特異的細菌信號。

 

  圖1. mini-BAL樣本與陰性對照樣本檢測到的不同的細菌信號

  Fig1. Evidence of distinct bacterial signal in mini-bronchoalveolar lavage specimens compared to negative control specimens.

 

  1.2 ARDS危重病人肺部菌群發生改變,檢測到腸道相關菌群的富集

 

  先前研究表明ARDS患者肺部微生物群存在腸道相關細菌富集的現象,本研究也期望通過與非ARDS危重患者比較,揭示ARDS患者肺部細菌的相關特征。如圖2所示,與無ARDS患者相比,ARDS患者肺部細菌DNA載量更高,而Shannon Diversity Index和Community richness兩項分析顯示兩者在菌群多樣性方面無顯著差異。

 

  進一步聚焦菌落組成,首先主成分分析直觀地展示了兩組樣本雖然存在較多的分類學上的重疊,但不可否認仍存在各自分離聚群的趨勢;利用mvahund也在統計學上證實菌群組成存在差異,基于分類學水平的比較得到完全一致的結論;通過biplot分析鑒定兩組各自特異性的菌種組成,結果顯示無ARDS患者以常見于健康個體的肺部菌群(Streptococcaceae spp., Veillonellaceae spp., Prevotellaceae spp.)以及陰性對照樣本中發現的菌群(Verrucomicrobiaceae spp., Flavobacteriaceae spp.)為主,而ARDS樣本主要特征群為Pasteurellaceae spp 和Enterobacteriaceae spp。通過對ARDS和非ARDS患者優勢菌群的相對豐度進行排序(圖2E),可以看出雖然兩組間有很多相同的分類單元,但ARDS患者肺部腸桿菌科含量顯著高于非ARDS患者(ARDS患者中腸桿菌科占菌群測序序列的12.5%,而在非ARDS患者中僅為0.18%)。使用基于無偏回歸(mvahund)和ensemble-learning(隨機森林)兩種分析方法鑒定得到的ARDS患者中顯著富集的細菌類群均為腸桿菌科。與已發表的另外一項研究結果進行對比分析時發現,本次研究鑒定出的豐度最高腸桿菌科(OTU0005,占所有腸桿菌分類序列的61.5%)與Panzer等人公布的與ARDS相關的腸桿菌科(OTU2119418)的代表性序列一致性高達96%,僅有3個堿基對不同。將與ARDS相關的OUT,在SILVA核糖體RNA數據庫找到匹配度最高的前20個序列,根據數據庫里找到的鄰近OTUs的注釋信息來看,證實上述兩個OUT特異性地歸于腸桿菌綱分類單元,包括Escherichia coli、Enterobacter spp.和Klebsiella Pneumoniae。綜上,ARDS患者肺部微生物群不同于非ARDS危重病人,主要表現為腸道相關菌群Enterobacteriaceae spp的富集。

 

  圖2. ARDS患者肺部微生物群發生改變

  Fig2. Lung microbiota are altered in patients with the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS).

 

  1.3 肺部微生物群可以預示危重病人臨床預后

 

  為探究mini-BAL標本的細胞載量(通過ddPCR對16S rRNA基因進行定量)能否預測ICU病人的預后,研究人員利用單變量分析,發現無論是連續變量還是分類變量分析,基線時患者的肺部細菌DNA載量增加都對應更短的無呼吸機天數。換言之,肺部細菌DNA每增加10倍,理想預后(脫離機械通氣)的HR風險比為0.43。而與低細菌載量的患者相比,基線時肺部細菌DNA載量處于上三分位值的患者在7、14、21和28天呼吸機停用和個體存活的可能性更小。

 

  考慮到肺炎在機械通氣患者中很常見,且是干擾肺部細菌群研究結論的潛在因素,因此本研究還對27位初步判定肺炎患者、以及其中7位復查符合CDC對疑似或確診肺炎診斷標準的患者分別進行了深入分析。即便控制了肺炎這一變量,無論是HR值還是模型的顯著性都未發生明顯改變,患者是否存在肺炎并不會影響肺部細菌DNA載量對預后的預測能力。隨后研究人員利用多因素分析,在控制了年齡、性別、疾病嚴重程度(APACHE IV評分)、是否疑似肺炎和有無ARDS等變量后,證實肺部細菌DNA載量,僅此一項指標即可預測臨床預后。

 

  隨后,探究了肺部細菌的多樣性能否預測ICU危重病人的臨床預后,結果顯示,肺部細菌多樣性(shannon多樣性指數)與ICU預后關系并不明確。基線時肺部細菌多樣性高的患者獲得了最理想的ICU治療效果,而菌群多樣性較低的患者治療結果次之,但差異未達到統計學顯著性。其他肺部細菌多樣性指標(菌群豐富度、菌群優勢度)也不能顯著預測ICU結局。最后研究了肺部細菌的群落組成是否可以預測ICU危重病人的預后。使用mvabund(基于模型的多因素豐度數據分析法)比較了患者無呼吸機天數與基線時肺部細菌群落結構的關系,發現基線時肺部整體的細菌群落構成可以顯著預測病人無呼吸機天數;使用隨機森林鑒定與不良預后相關的分類單元,發現與腸道相關的Lachnospiracaeae和Enterobacteriaceae與無呼吸機天數間的關系最緊密。反過來驗證這些分類單元預測不良臨床結局的效果,如圖4B所示,檢測到Lachnospiracaeae的患者對應不良預后,而Enterobacteriaceae與無呼吸機天數的關系不顯著。

 

   綜上,危重病人肺部微生物群中細菌載量和菌落組成(特別是腸道相關菌群的富集)可以預測預后情況。

 

  

  圖3. 肺部細菌載量可以預測機械通氣危重患者28天內的臨床預后

  Fig3. The burden of bacterial DNA detected in mini-BAL specimens was predictive of total ventilator-free days.

 

  圖4. 肺部細菌的多樣性與無呼吸機天數關系不顯著,但菌落結構可以預測無呼吸機天數

  Fig4. Community diversity of lung bacteria did not significantly predict ventilator-free days, while community composition of lung bacteria was significantly predive of ventilator-free days.

 

  結論

 

  本研究首次證明肺部微生物群的變化可用于預測危重病人的臨床預后,這一關鍵發現與早先很多非ICU患者肺部微生物組研究結論一致,肺部微生物群同樣可以預測肺纖維化[2-3]、慢性阻塞性肺疾病[4]、支氣管擴張[5-6]和呼吸道感染易感嬰兒[7]的疾病進展。雖然這些研究在不同疾病背景下證實了肺部微生物群是疾病進展的一個關鍵因素,但肺微生物群能否被干預、調節,并作為減輕肺部損傷、治療相關疾病的潛在治療方案,仍然未知。使用無菌和抗生素暴露的小鼠進行動物實驗,發現改變微生物組確實會影響宿主對肺部炎癥、損傷的易感性和死亡率,但是肺部微生物在急性和慢性肺損傷發病機制所發揮的作用還有待研究,未來研究需要進一步探討微生物組在肺部疾病中發揮的作用是通過遠端(腸道-肺)宿主-微生物間的互作來實現還是改變只是局限在肺部病灶。

 

  參考文獻

 

1. Dickson R P, Schultz M J, van der Poll T, et al. Lung microbiota predict clinical outcomes in critically ill patients[J]. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2020, 201(5): 555-563.

2. Molyneaux P L, Cox M J, Willis-Owen S A G, et al. The role of bacteria in the pathogenesis and progression of idiopathic pulmonary fibrosis[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2014, 190(8): 906-913.

3. O’Dwyer D N, Ashley S L, Gurczynski S J, et al. Lung microbiota contribute to pulmonary inflammation and disease progression in pulmonary fibrosis[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2019, 199(9): 1127-1138.

4. Leitao Filho F S, Alotaibi N M, Ngan D, et al. Sputum microbiome is associated with 1-year mortality after chronic obstructive pulmonary disease hospitalizations[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2019, 199(10): 1205-1213.

5. Sibila O, Laserna E, Shoemark A, et al. Airway bacterial load and inhaled antibiotic response in bronchiectasis[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2019, 200(1): 33-41.

6. Rogers G B, Zain N M M, Bruce K D, et al. A novel microbiota stratification system predicts future exacerbations in bronchiectasis[J]. Annals of the American Thoracic Society, 2014, 11(4): 496-503.

7. Bosch A A T M, Piters W A A S, van Houten M A, et al. Maturation of the infant respiratory microbiota, environmental drivers, and health consequences. A prospective cohort study[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2017, 196(12): 1582-1590.

 

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