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文獻分享:適用于病毒診斷及基因組監測的加標引物富集宏基因組測序方法

  • 分類:行業資訊
  • 作者:
  • 來源:
  • 發布時間:2020-05-06 18:38
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【概要描述】

文獻分享:適用于病毒診斷及基因組監測的加標引物富集宏基因組測序方法

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詳情

 

   一、基本信息簡介

 

   1.文章標題:Metagenomic sequencing with spiked primer enrichment for viral diagnostics and genomic surveillance

 

   2.作者:Xianding Deng1,2, Asmeeta Achari1,2, Scot Federman1,2 et al.

 

   3.作者單位:Department of Laboratory Medicine, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USAUCSF– Abbott Viral Diagnostics and Discovery Center, San Francisco, CA, USA

 

   4.雜志情況:Nature microbiology . Published online March 9, 2020.

 

   5.IF: 14.3

 

   二、內容概述

 

  事實證明宏基因組技術在廣譜致病菌檢測及疫情爆發的基因組監測中具有重要作用。然而,對于低豐度致病菌的感染,靶向擴增技術是提高致病菌檢測靈敏度的必要步驟。現在常見的PCR技術及捕獲探針技術因高成本、復雜的操作流程、交叉污染等原因,限制了其技術的應用。本研究建立的一種靶向富集RNA病毒的方法,即加標引物富集技術(Metagenomic sequencing with spiked primer enrichment MSSPE),該技術可以保留其它致病菌的檢測靈敏度不受影響的同時,提高目標菌株的檢測靈敏度。

 

   1.樣本情況

   1)樣本類型:塞卡病毒、登革熱病毒、埃博拉病毒、登革熱病毒等14種病毒的培養物以及臨床陽性血漿,病毒檢測為陰性的血漿作為對照。2)檢測方法:實時定量標準曲線分析測定待測樣本的病毒載量。通過作者開發的自動算法,根據每個菌種的參考基因組,設計引物序列,于宏基因組反轉錄過程中加入引物探針,對目標菌種進行富集。針對ZIKV樣本,文中使用捕獲及多重PCR的富集方法與MSSPE進行對比,以評價MSSPE方法的靈敏度和準確性。

 

  MSSPE引物設計流程

 

  MSSPE宏基因組建庫流程

 

   2.研究策略

 

   本文公布了一種新的病毒富集方法,并通過與傳統方法MSSPE(多重PCR擴增技術、探針捕獲技術)對比,評價了該方法的應用價值。

 

   3.研究結果

 

   1)研究基于illumina及nanopore測序平臺,測試了不同引物panel在不同引物濃度下,目標菌株富集情況。65例培養樣本以及27例臨床陽性樣本在不同拷貝數濃度下,使用MSSPE富集后,發現低于10cp/ml的培養樣本以及低于100cp /ml臨床陽性樣本的富集倍數均值均顯著高于其它濃度。

 

   且研究證明MSSPE方法可以應用于illumia和nanopore測序平臺,不同病毒的最低檢出濃度不同。其中naopore測序平臺因測序錯誤導致barcode拆分錯誤,引起了假陽性。

 

   2) 實驗證明,MSSPE捕獲后,可以有效提升病毒的基因組覆蓋度。但病毒濃度低于10 cp ml?1時,效果不明顯。此外,經測試,MSSPE富集菌株后,可以正確的組裝病毒基因組,表明MSSPE技術具有監測疫情爆發時病毒基因組變異的能力,不會因為共有基因組而導致組裝偏差。

 

 

   3) MSSPE技術與多重PCR及捕獲技術相比,多重PCR和捕獲技術能夠檢測到臨床陽性樣本中低拷貝數濃度的樣本,MSSPE技術檢出的覆蓋度較有優勢,但多重PCR和捕獲技術重復reads占比高,且引入其他的污染。

 

   4.研究結論

該研究評估了14種不同病毒的MSSPE,產生了中位數十倍的富集效果,并且與普通mNGS流程相比,基因組覆蓋范圍平均增加了47%(±16%)。MSSPE檢測病毒的特異性與多重PCR法相當,檢測受感染患者血漿樣品中的寨卡病毒、埃博拉病毒、登革熱、基孔肯雅熱和黃熱病病毒的準確性達到95%。值得注意的是,MSSPE成功地富集了Powassan和Usutu的再生或共感染的病毒序列。SSPE方法簡單、成本低、快速,并且可部署在臺式或便攜式納米孔測序儀上,從而使該方法直接應用于診斷實驗室。

 

   三、討論關鍵點

 

  問題:如何快速、低成本、無偏好提高宏基因組檢測低濃度致病菌的靈敏度?

 

  發現:本研究提出了一種新的快速、低成本、無偏的致病菌富集方法:MSSPE。該方法可以通過對多種致病菌進行探針引物設計,在無特殊外源菌引入以及不增加實驗難度的情況下,完成目標菌株富集,為疫情爆發情況下,監測低濃度致病菌的基因組變異情況提供了嘗試思路。

 

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